日本小児循環器学会雑誌 Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery

移植後リンパ増殖性疾患（PTLD）とは，固形臓器や造血幹細胞移植後の患者で起こる多様なリンパ増殖性疾患の総称で，伝染性単核球症様の良性疾患から，悪性リンパ腫まで多様な病理像を包括する^1）．PTLDの症状は，発熱，体重減少，リンパ節腫脹，倦怠感などの非特異的な全身症状に代表され，消化器症状，皮膚症状，神経症状などが見られることもある．発症にはEpstein–Barr（EB）ウイルスによる感染細胞の腫瘍化，そして増殖した異常細胞をアポトーシスに導く免疫機構を移植後投与される免疫抑制剤が抑制する機序が関わっていることが多い．このため，固形臓器移植後の患者では移植後の血中EBウイルス-DNAのモニタリングが推奨されている^2）．増殖細胞はB細胞由来であることが多いが，T細胞やNK細胞由来のPTLDも知られている^3）．

PTLDの治療は，臨床像および病理像によって免疫抑制薬の調整・リツキシマブ投与・化学療法などの単独療法あるいは併用療法から選択される．リツキシマブは抗CD20モノクローナル抗体で，B細胞由来のPTLDに有効とされている．固形臓器移植患者のPTLDに対して，リツキシマブを免疫抑制薬の減量後，あるいは同時に投与した時に，その奏効率は44～79％とされている^4–7）．2019年にアメリカ移植学会が発表した固形臓器移植患者のPTLDに関するガイドラインにおいても，免疫抑制薬を減量した後も進行するCD20抗原陽性のPTLDに対する使用が推奨されている^2）．ただ，リツキシマブはCD20抗原陽性のPTLD以外では無効であり，PTLDの免疫表現型については，組織の切除生検（困難であれば針生検）を行い，免疫染色やフローサイトメトリーを用いて調べることが推奨されている^2, 8）．

今回我々は，小児心臓移植後のPTLDにおいて，末梢血のフローサイトメトリーおよびEBウイルス感染細胞同定解析を用いて増殖細胞がB細胞由来であることを証明し，生検結果が判明するより前にリツキシマブを投与開始できた症例を経験した．

なお，本論文については東京大学医学部附属病院の倫理委員会の承認を得ている．

患者

2歳2か月男児

主訴

発熱・鼻汁・咳嗽・下痢

現病歴

1歳10か月時，拡張型心筋症に対して心臓移植を施行された．2歳2か月時，発熱・気道症状・下痢が出現したため当院受診した．血液検査で好中球数減少があり，発熱に対する精査加療目的で当院入院となった．

既往歴

拡張型心筋症．その他特記すべき既往なし

心臓移植施行時のSerostatus

EBウイルス: Donor（＋），Recipient（−），CMV: Donor（−），Recipient（＋）

内服薬

バルガンシクロビル（VGCV），ST合剤，タクロリムス（Tac：目標血中濃度10～12 ng/mLであり，移植後から当科入院までの血中濃度の推移はFig. 1参照），ミコフェノール酸モフェチル（MMF），エナラプリル，ジルチアゼム，フロセミド，アスピリン，その他（鉄剤，酸化マグネシウム製剤，整腸剤，去痰薬）

Fig. 1 Tacrolimus trough levels after heart transplantation

The target trough level was was 10–12 ng/mL until 3 months after transplantion, and 8–10 ng/mL from 3 to 6 months after transplantation. Tac, tacrolimus.

入院時現症

身長 81.3 cm，体重 11.34 kg

体温 37.7°C，血圧 108/48 mmHg，脈拍 110 bpm，酸素飽和度 97％（室内気）

頭部：咽頭発赤なし

頸部：リンパ節腫脹なし

胸部：呼気性喘鳴聴取

腹部：平坦 軟 腸蠕動音正常

四肢：浮腫なし 末梢冷感なし

入院時血液検査所見

好中球減少・貧血のほか，CRPの上昇を認めた（Table 1入院後の血液検査）．

胸部X線画像

移植後と比して心拡大の増悪，肺野の透過性低下を認めない．

心電図

電位変化，不整脈の出現を認めない．

心臓超音波検査

心室壁増加率・心収縮・拡張能の低下を認めない．弁逆流の増悪，心嚢水の出現も見られない．

入院後経過（Fig. 2）

入院時の画像検査，生理検査からは拒絶反応は強く疑わず，上気道症状および下痢症状からは急性上気道炎が疑われた．一方，貧血および好中球減少があり，炎症による骨髄抑制のほか，薬剤による発熱・好中球減少の可能性も考慮し，MMFを漸減しVGCVを中止した．易感染性のため，ピペラシリン/タゾバクタム（PIPC/TAZ）を投与開始した．

Fig. 2 Tacrolimus trough levels, body temperature and CRP during hospitalization

EVL, everolimus; PIPC/TAZ, piperacillin/tazobactam; RIX, rituximab; Tac, tacrolimus trough levels.

入院3日目以降，体温は37.1～37.7°Cで推移し，気道症状・下痢症状は改善傾向だった．CRPも低下傾向だったため，入院5日目にPIPC/TAZを中止した．貧血，好中球減少についても，入院6日目にHb 6.2 mg/dL，好中球数168/µLまで低下したが，入院10日目にはHb 6.4 mg/dL，好中球数840/µLと改善傾向だった．同日よりMMF減量に伴い，エベロリムスを内服開始した．しかし，その後も解熱は維持できず，気道症状・下痢症状は再増悪し，入院10日目にはCRPの再上昇を認めた．入院22日目に行った血液検査では，それまで見られていなかった異型リンパ球の出現，および肝逸脱酵素の上昇を認め（Table 1），追加で行った血中EBウイルス-DNA定量ではDNA量の増加を認めたため，EBウイルス感染症と診断した（Fig. 3（a））．末梢血のフローサイトメトリーでは，CD19陽性細胞の増加を認めた一方，CD3陽性細胞，CD56陽性細胞，CD8陽性細胞は増えていなかった．このことから感染細胞はB細胞が疑われ，また細胞障害性T細胞が誘導されていないと考えられた（Fig. 4）．同時期に頸部リンパ節腫脹を指摘され，PTLDが疑われたためTacを減量した．入院29日目以降は39°C以上の発熱が持続し，入院30日目に末梢血の感染細胞同定解析を施行したところ，Fig. 3（b）の結果が得られた．その他の分画については，γδ-T細胞とCD56-CD16＋NK細胞が考えられたが，FCMではこれらの増加はなく，感染細胞の主体がCD19陽性細胞であることが判明した．入院31日目に撮像した全身のFDG-PETにて右頸部リンパ節への異常集積を認め（Fig. 5（a）），入院35日目に同部位のリンパ節生検を施行した．入院37日目，発熱・気道症状・下痢症状に加え，経口摂取不良・傾眠傾向も進行し全身状態の悪化を認めたため，リツキシマブを投与開始した．同日より解熱する日が出現し，各症状の改善を認めた．入院43日目，生検病理では，核小体が明瞭で，やや歪んだ核を有する中～大型の異型リンパ球の増殖あり，CD20が陽性だった．また，免疫染色ではEBER-ISH, LMP-1, EBNA2が陽性であり，以上から単形性PTLD，特にびまん性大細胞型B細胞性リンパ腫と確定診断した（Fig. 6）．入院45日目以降は解熱が維持されるようになり，入院51日目に2回目のリツキシマブ投与を行い，入院61日目以降はリツキシマブおよび化学療法の併用療法（R-THP-COP療法）で加療継続する方針となった．

Fig. 3 Copies of EBV-DNA in patient’s peripheral blood

(a) Solid line shows the amount of EBV-DNA in blood cells (copies/µg). Broken line shows the amount of EBV-DNA in blood plasma (copies/mL). No EBV-DNA was detected in blood cells on day 59, in blood plasma on day 37 and 45. (b) Amount of EBV-DNA in each fractions of peripheral blood cells on day 30 (copies/µg).

Fig. 4 Flowcytometry of patient’s peripheral blood mononuclear cells on day 22 of admission shows increase in CD19＋ cells, but not in CD3＋ cells, CD 56＋ cells, nor CD16＋ cells

Fig. 5 Fluorodeoxyglucose-positron emission tomography (FDG-PET)

(a) Taken on day 31 of hospitalization. FDG accumulation are seen in the right cervical nodes. (b) Taken on day 121 of hospitalization. FDG accumulation seen in the right cervical nodes earlier had disappeared.

Fig. 6 Microscopic images of the patient’s lymph node tissue

(a, b) H & E staining shows diffuse proliferation of mid-to-large-sized atypical cells with enlarged nucleus and prominent nucleoli. (c) CD20 positive. (d) CD3 negative. (e) MIB-1 positive. (f) EBER-ISH positive. (g) LMP-1 weakly positive. (h) EBNA positive.

なお，発症後約4か月後に撮像したFDG-PETでは，初回に見られた右頸部リンパ節への集積は消失していた（Fig. 5（b））．

感染細胞同定解析の手法は，主に二つあり，一つは，末梢血中の単核球の免疫染色，およびEBウイルス-encoded small RNA（EBER）と結合するペプチド核酸プローベを用いたin situ hybridizationを行い，フローサイトメトリーでそれぞれの細胞分画におけるEBERの発現頻度を見る方法である^9）．もう一つは，末梢血の単核球を磁気細胞分離装置を用いて表面抗原ごとに分けて，それぞれの分画からDNAを抽出してリアルタイムPCRを行う方法である^10）．今回は後者の手法が行われた．

小児心臓移植後のPTLDにおいて，末梢血の感染細胞同定解析により感染細胞がB細胞由来であることを調べられ，これによりリツキシマブの適応があることがわかった．リツキシマブは固形臓器移植後のPTLDに対して奏効率が高く，リツキシマブを早期から使用した方がセカンドラインで導入するより予後が良い可能性も指摘されている^11）．その一方，リツキシマブの有害事象として，アレルギー反応や好中球減少のほか，心臓・肺・腎臓・皮膚などの臓器障害が知られており，安易なリツキシマブの投与は望ましくない^12）．これらのことからPTLDの初期治療において，リツキシマブ投与の適応があるかを早めに把握することは臨床的に重要であると言える．

また，感染細胞同定解析は，早急な生検の実施が困難なPTLD症例に対しても有用である．PTLDは病理結果によって確定診断するが，本症例のように生検結果がわかる前に治療介入が必要なケースもある．具体的には，発熱と血圧低下を特徴とする劇症型のPTLDのときや致死的な合併症で生検が安全に行えないときなどである^13）．本症例は劇症型PTLDではないものの，傾眠傾向を呈しており，生検結果がわかる前の早急の治療介入が必要と判断した．これらのように生検結果が判明することに先んじて治療介入が必要なPTLD症例において，末梢血の感染細胞同定解析はリツキシマブの適応があるかを検討する良い判断材料になると考えられる．

ただ，臨床応用についての課題がいくつかある．一つは，末梢血の感染細胞同定解析で確認される増殖細胞と，生検組織の増殖細胞との間に乖離がないかという疑問はある．2019年に行われた先行研究では，末梢血中にEBウイルスが高値で検出された様々な血液疾患の患者291人について末梢血の感染細胞同定解析を行い，それぞれの患者で診断された疾患との関連を調べている^14）．この関連を調べた包括的な研究はこれが初であり，この研究に含まれるPTLD患者3人では感染細胞と病態は一致していた．さらに，同研究のリンパ腫の患者でも末梢血の感染細胞とリンパ腫の細胞の系統は概ね一致していたが，例外的に血管免疫芽球性T細胞リンパ腫の患者6人では感染細胞は主にB細胞であり，系統が一致していなかった．本症例では，末梢血の感染細胞と生検組織の増殖細胞とは一致しており，後方視的にはリツキシマブ投与の適応はあった．あらゆるPTLDで増殖する細胞と，末梢血の感染細胞が一致するかは未解明であり，前述の研究をPTLDに限定して，大人数の規模で行う必要があるだろう．

もう一つには，感染細胞同定解析だけではリツキシマブの適応の有無がわかったとしても，PTLDの悪性度まではわからず，化学療法の必要性の有無やレジメン，予後予測，腫瘍崩壊症候群などの合併症のリスクについては評価できない．感染細胞同定解析は組織生検に比べ得られる情報が少なく，組織生検の補助検査という位置づけであり，正確な診断および管理のためには組織生検は必須である．

移植後患者に対しては，定期的にEBウイルス-DNA定量を行い，コピー数の増加が見られた場合は可能な限り早期に感染細胞同定解析および組織生検を行い，それらに基づき治療を決定すべきである．ただし生検結果が待てず，早期介入が必要な重症例では，感染細胞同定解析がリツキシマブの適応の有無を判断するうえで有用であると考えられる．末梢血の感染細胞と組織の増殖細胞との関連についての更なる研究が望まれる．

本症例を通して，小児心臓移植後のPTLD患者に対する末梢血の感染細胞同定解析はリツキシマブの適応を判断するうえで有用な可能性が示唆された．今後，PTLD患者における末梢血の感染細胞と組織の増殖細胞に乖離がないかについての研究が望まれる．