日本小児循環器学会雑誌 Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery

再生医療は薬物療法や外科的治療などでは根治できない難治性疾患に対する治療として大きな注目を集めており，将来的には臓器移植に代わる置換型の再生組織・臓器の再生も期待されている．これまでに自己由来の細胞浮遊液を不全組織内へ注入することにより組織を再生させる細胞注入療法がすでに臨床応用されている．細胞注入療法に次ぐ再生治療法として合成高分子や天然高分子から作製した生分解性の足場（スキャフォールド），または脱細胞化した組織に細胞を播種することで構築した組織を移植するティッシュエンジニアリング技術が追及されており，骨，軟骨，皮膚など細胞密度が低く血管要求性の低い組織に関しては臨床応用も行われている．しかしこれまでのティッシュエンジニアリング技術では拡散による酸素・栄養の供給ならびに老廃物の除去の限界に起因する構築可能な組織厚やその機能に関する制限があり，特に心臓，肝臓，腎臓など細胞密度が高く血管要求性が高い組織の構築には革新的な技術開発による再生組織内への機能的血管網付与を実現することが必須となっている．本稿では細胞シート工学を基盤とした心筋組織の再生と機能的血管網付与による3次元組織のスケールアップ技術，ならびに補助ポンプ型立体組織の作製について紹介する．

心筋に対する細胞移植治療の研究が始まったのは1990年代前半で，アメリカのSoonpaaらは心臓に移植されたマウス胎児心筋細胞はホスト心筋に生着することを示した¹⁾．その後，心筋細胞のみならずさまざまな種類の細胞を使った細胞懸濁液移植は心機能の回復を助けることが報告された²⁾．心筋再生における細胞ソースの一つとして，虚血に対し比較的耐性があるとされる骨格筋の筋芽細胞が代替として用いられてきた．フランスのMenascheらは2003年に患者本人の骨格筋より採取した筋芽細胞の注入移植（MAGIC II study）を冠動脈バイパス術と併用して行ったところ心機能が回復することを報告した³⁾．しかしながら不整脈を引き起こし死亡する例もあったため，抗不整脈薬や植込み型除細動器の併用が必須であった．近年，高い心筋分化能力ならびに増殖能を持つ細胞ソースとして盛んに研究されているのはES細胞とiPS細胞で，ともにヒト細胞からの心筋細胞への分化誘導法も確立され，心不全動物モデルへの移植実験においても分化誘導させた心筋細胞はホストの心臓に生着し心機能も改善されることが示されている^4,5)．iPS細胞はES細胞研究が持っているヒト胚を破壊するという道徳的な倫理的問題を解決できるため細胞のバンク化による他家移植の実現が大きく期待されている．

生体内や培養系で体の組織構造を再生させる研究の領域をティッシュエンジニアリングと呼ぶが，これは1980年代後半にマサチューセッツ工科大学のLanger博士とハーバード大学のJoseph Vacanti医師が提唱した概念で，医学と工学の融合により生まれた学際的な学問である．組織の再生には細胞，細胞の足場となる細胞外マトリックスや細胞の分化と増殖のためのサイトカインが必要であるとし，その足場をポリ乳酸やその共重合体からなる生分解性のスキャフォールドを用いて作製した．方法は3次元の生分解性支持体に細胞を播種し培養を行ったのちに生体内へ移植する．生体内では支持体が緩やかに分解・吸収され，細胞が産生する細胞外マトリックスと置換されるため，生体に類似した組織構造が再生できるというものである⁶⁾．

心筋組織の再生においても同様に，細胞の足場となる生分解性スキャフォールドを用いるのが主流となっている．組織工学的手法を用いることでの大きな利点は，細胞注入療法で課題となっている細胞の流出や壊死による細胞の損失を克服できること，また細胞注入やサイトカイン療法では達成できない先天性心疾患などの欠損部位に対する治療を可能としうることである⁷⁾．細胞を播種する支持体としてゼラチン，アルギン酸またはPGAの多孔性スポンジなどを用いた研究が報告されている^8–10)（Fig. 1A）．またコラーゲン溶液と心筋細胞を混和しモールド内で培養することにより3次元の心筋組織を構築する研究も報告され，この研究ではin vitroでの伸展負荷により心筋組織に配向性を持たせ，さらに心筋細胞を肥大させることも示されている¹¹⁾（Fig. 1B）．さらには溶液状フィブリンあるいはコラーゲン溶液と細胞を混ぜ合わせたのち，不全心筋部に注入するという細胞注入療法と組織工学との中間のアプローチも報告されており¹²⁾，これにより細胞懸濁液の移植時に問題となる細胞の損失を軽減できる可能性も報告されている（Fig. 1C）．

Fig. 1 Cardiac tissue reconstruction using a tissue engineering approach

A: Dissociated cells are seeded into prefabricated porous scaffolds or decellularized tissue matrices. B: A mixture of dissociated cells and biodegradable liquid biomolecules is seeded into an appropriate mold, and the molecules are then polymerized. C: Mixtures of cells suspended within biodegradable liquid biomolecules are set into the injector. D: Entire cell sheets released from temperature-responsive culture surfaces are layered. Cell sheets adhere to each other via a biological extracellular matrix, resulting in scaffold free 3-D tissue.

組織工学により再生した心筋組織を心筋不全部へ移植する研究においては，Liらは生分解性のメッシュ状ゼラチンにラット胎児心筋細胞を播種し培養した後，これをグラフトとして心筋障害モデルへ移植を行ったところ，心筋細胞を播種していないゼラチンメッシュの移植に比べ左心室収縮期圧が改善されることを示した⁸⁾．またLeorらはアルギン酸を使った多孔性の足場へラット胎児心筋細胞を播種し，心筋梗塞モデルに移植した．その結果，左心室収縮能の改善は認められなかったものの心筋リモデリングによる左心室拡大を抑制できることを報告した⁹⁾．さらにZimmermannらはコラーゲン溶液とラット新生仔心筋細胞を混和しシリコーンモールド内で培養することにより作製した3次元心筋組織を心筋梗塞モデルへ移植したところ，移植組織が不整脈を誘発することなく正常心筋と電気的に結合することを明らかにした．このモデルでは左心室収縮能が改善し，左心室拡大も抑制されることが示された¹¹⁾．

組織再構築を行う際に細胞の足場としてスキャフォールドを使用する方法は，スキャフォールド内部へ十分に細胞数を播種することが難しく，結果として細胞成分が少なく大量の結合組織が多い組織ができあがってしまう．心臓弁や軟骨など細胞が疎な組織の作製には適するが，心臓や腎臓，肝臓など細胞が密で複雑な構造と高い機能を持つ組織を作製するには新たな技術開発が必要となっている．

そのような中，我々はスキャフォールドを用いることなく組織を再構築する細胞シート工学と呼ぶ技術を開発し心筋再生の研究を進めてきた．細胞シート工学とは培養皿表面に加工を施し温度変化のみで細胞の接着・脱着を制御できるという技術で，表面に修飾されているポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（PIPAAm）は水中32°Cに下限臨界溶液温度をもつ温度応答性高分子で，この高分子を電子線により共有結合的に固定すると，37°Cでは弱疎水性になり細胞が接着し，32°C以下に温度を下げると表面が親水性に変化し細胞が脱着する表面ができる．従来，培養細胞を回収するにはトリプシンなどのプロテアーゼを使用するが，この方法では細胞と培養皿表面を接着させている接着蛋白を分解するばかりか細胞膜表面の蛋白までも分解してしまう．しかし温度応答性培養皿を使用した場合，温度を降下させるだけで細胞–細胞間接着や細胞外マトリックスの構造と機能を破壊することなく細胞をシートとして回収できる（Fig. 2）．さらにこの細胞シートを積層化することにより3次元組織を構築できる（Fig. 1D）．また積層化により再構築された組織は細胞とそれが産生する微量の細胞外マトリックスのみからなるため，スキャフォールドを使用する時に生じる問題を回避できる¹³⁾．

Fig. 2 Cell-sheet-based tissue engineering

Culture cells can be harvested as cell sheet using temperature-responsive culture dishes created by grafting the temperature-responsive polymer poly(N-isopropylacrylamide) to tissue culture dishes. Under culture conditions at 37°C, the dish surfaces are relatively hydrophobic and cells attach and proliferate. Wheh the temperature is reduced below 32°C, the polymer surface becomes hydrophilic, allowing spontaneous cell detachment.

温度応答性培養皿を用いて新生仔ラットの心筋細胞シートを作製しin vitroで2枚積層化を行ったところ，積層化された心筋細胞シート間に数十分で形態的かつ電気的な結合が形成され，同期して自律拍動する組織が作製できることが示された^14,15)．またこの積層化心筋細胞シートをラットの背部皮下組織に移植したところ，ホスト心臓の心電図とは異なる移植心筋グラフトに固有の電位が測定され，移植組織は肉眼で拍動を確認できるレベルであった．移植組織内には毛細血管網が新生し，心筋組織は円柱状に伸びたサルコメア構造とギャップジャンクションまたはデスモソームなど生体心筋組織によく似た組織像であった¹⁶⁾．さらにこの移植された心筋グラフトは拍動を維持したままラットの寿命である約2年間の間，生着し続けることも示された¹⁷⁾．

積層化心筋細胞シートの心不全モデルへの移植においては，心筋グラフトとホストの正常心筋との間に心筋細胞同士の結合が起こるとともに，それらの細胞間にギャップジャンクションが形成され電気的な結合が確立されることが示された¹⁸⁾．また細胞懸濁液移植に比べ細胞の生着率が圧倒的に良いことも明らかにされた¹⁹⁾．さらに血管内皮細胞と心筋細胞を共培養して細胞シートを作製すると血管内皮細胞の網目状のネットワークが構築され²⁰⁾，その心筋グラフトを移植すると網目状の血管内皮細胞のネットワークが直接的に血管新生に寄与し，虚血心の機能回復を加速させることも明らかとなった²¹⁾．

我々は1層から数層までに重ねた細胞シートの再生治療研究を行いながら，同時に再生組織のスケールアップによる高機能化も進めている．組織の高機能化には再生組織内へ血管網の付与を行い，酸素・栄養の透過性を向上させ老廃物の排出を図る必要があるが，一つの方法として，最初に移植した積層化心筋細胞シートにホスト側からの十分な血管新生を待ち，新たな積層化心筋細胞シートを24時間ごとに段階的に移植する手技を考案した．この方法によってin vivoにおいて約1 mm厚の収縮力が増大した心筋組織を再生させることを可能とした²²⁾．またこれを受けてin vitroで再生組織内へ血管網を付与し厚みのある心筋組織の再生を試みた．まず血管新生の場となる血管床と組織灌流用バイオリアクターを開発し，血管床上へ積層した心筋細胞シートへの毛細血管新生の評価を行った（Fig. 3）．血管床はラット大腿動静脈を含む筋組織を外科的に成形し1週間生体内へ留置することにより毛細血管の動静脈短絡を誘導させ，灌流液が動脈から組織さらに静脈へ戻るような組織を作製した．血管内皮–心筋共培養細胞シートを血管床上へ積層化しb-FGFを添加した灌流液を用いて組織灌流培養を行うことで，3日後には心筋組織内で再生された毛細血管と血管床の毛細血管との間に血管を介したつながりができることを確認した．また3層の細胞シートを段階的に4回積層化することで約200 µmのより厚みのある心筋組織の構築を可能とした．さらに細胞シートの段階的積層により作製した血管付き心筋組織を生体へ吻合移植を行ったところ，移植された組織は移植2週間後において細胞の機能を保持したまま生着していることが確認できた²³⁾．また，血管内皮–心筋共培養細胞シートを微小流路付きコラーゲンゲルの血管床モデルを用いて還流培養することで，微小流路と積層化細胞シートの毛細血管を血管内皮細胞の増殖，および移動によりつなぐことにも成功した²⁴⁾．

Fig. 3 Induction of microvascular network within the engineered 3D cardiac tissues in vitro

Cardiac cell sheets co-cultured with endothelial cells were transferred onto a vascular bed containing connectable blood vessels, which was perfused with a bioreactor system.

我々はさらに効果的な治療法の開発を目指し，細胞シート工学による新展開として補助ポンプとなりうる管状心筋組織の構築にも着手している．これまでの報告ではYostらは管状コラーゲンの管腔に心筋細胞を数回に分けて注入することでin vitroにおいて自律拍動するチューブを作製できることを示した²⁵⁾．一方で我々はin vitroにおいて管状フィブリンゲルを足場にしてその外周に心筋細胞シートを巻きつけることによりチューブ状心筋組織を作製した．この管状心筋組織は肉眼レベルで拍動するとともに管腔内圧を生じた²⁶⁾．さらに心筋細胞シートを大動脈外周に巻きつけることで移植可能な管状心筋組織を作製し，異なる個体の大動脈との置換移植を行った（Fig. 4）．その結果，置換移植後4週間においてホストとは異なる管状心筋組織単独の自律拍動が肉眼および電位測定で確認でき，さらに内圧測定では約6 mmHgの内圧較差が計測された．組織切片では動脈の外周に心筋組織の生着が認められ，規則正しい筋節構造，多量のミトコンドリアおよびデスモソームが確認された．また腹腔内移植群と大動脈置換移植群で比較したところ，その組織厚は腹腔内移植群に対し大動脈置換移植群の場合では有意に増大し，BNPおよびMHC-α, βの遺伝子発現量も明らかに増大することが認められた．これらの結果より細胞シートを用いて作製した再生心筋チューブは生体に類似した組織構造を示し，さらにin vivoでの拍動下で心筋組織がストレッチされることにより再生心筋組織が成長・肥大することが明らかとなった²⁷⁾．また内圧較差が生じたことはホストの血行動態を変化させ得る可能性を示しており，組織再生から臓器再生への先駆けになるものと考える．

Fig. 4 Fabrication and replacement of cardiac tubes

Individual cardiac cell sheets are sequentially wrapped around a resected aorta to produce pulsatile cardiac tubes in vitro. After resection of the host aorta, the myocardial tube is replaced in a host blood vessel.

今後，先に述べたin vitroでの組織スケールアップ技術を管状心筋組織の構築に応用することで，より厚く収縮力が増大した補助ポンプとなる管状心筋組織を作製することが可能になると考える．

血液循環を制御可能とする組織・臓器を構築するには，ヒトへ移植可能な心筋細胞や再生組織のスケールアップなどの課題を克服する必要があるが，ティッシュエンジニアリングによる再生医療研究はさまざまなアプローチにより飛躍的に進んでおり，小児の先天性心疾患も含めた重症心不全に対する治療への応用として重要なものになると予想され，さらなる努力と学際的な技術開発により達成しうるものと信じる．