先天性心疾患における不死化B細胞株由来induced pluripotent stem（iPS）細胞の樹立

Nanako Kawaguchi; 川口奈奈子; Emiko Hayama; 羽山恵美子; Yoshiyuki Furutani; 古谷喜幸; Mitsuyo Shimada; 島田光世; Keisuke Okita; 沖田圭介; Yoji Nagashima; 長嶋洋治; Daiji Takeuchi; 竹内大二; Rumiko Matsuoka; 松岡瑠美子; Toshio Nakanishi; 中西敏雄

Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery 31(6): 313-319 (2015)
doi:10.9794/jspccs.31.313

原著Original

先天性心疾患における不死化B細胞株由来induced pluripotent stem（iPS）細胞の樹立Establishment and Characterization of Induced Pluripotent (iPS) Stem Cells Derived from Immortalized B Cells of Cardiac Channelopathy Patients

川口奈奈子¹，羽山恵美子¹，古谷喜幸¹，島田光世¹，沖田圭介²，長嶋洋治³，竹内大二¹，松岡瑠美子⁴，中西敏雄¹Nanako Kawaguchi¹, Emiko Hayama¹, Yoshiyuki Furutani¹, Mitsuyo Shimada¹, Keisuke Okita², Yoji Nagashima³, Daiji Takeuchi¹, Rumiko Matsuoka⁴, Toshio Nakanishi¹

¹ 東京女子医科大学医学部循環器小児科教室Department of Pediatric Cardiology, School of Medicine, Tokyo Women's Medical University ◇ 〒162-8666 東京都新宿区河田町8番1号Kawada-cho 8-1, Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

² 京都大学iPS細胞研究所初期化機構研究部門Department of Reprogramming Science, Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University ◇ 〒606-8507 京都府京都市左京区聖護院川原町53番地Shogoin Kawahara-cho 53, Sakyo-ku, Kyoto-shi, Kyoto 606-8507, Japan

³ 東京女子医科大学医学部病理診断科教室Department of Surgical Pathology, School of Medicine, Tokyo Women's Medical University ◇ 〒162-8666 東京都新宿区河田町8番1号Kawada-cho 8-1, Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

⁴ 若松河田クリニックWakamatsu-Kawada Clinic ◇ 〒162-0054 東京都新宿区河田町10番7号グリーンヒルズ河田町2階Green Hills Kawada-cho 2F, Kawada-cho 10-7, Shinjuku-ku, Tokyo 162-0054, Japan

受付日：2014年12月24日Received: December 24, 2014

受理日：2015年8月31日Accepted: August 31, 2015

発行日：2015年11月1日Published: November 1, 2015

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背景：先天性心疾患患者や遺伝性不整脈患者で観察される心電図の波形異常は，心筋細胞におけるチャネルの異常や細胞肥大などによって生じる．我々は，これまでに先天性心疾患患者や遺伝性不整脈患者からEpstein–Barr（EB）ウイルス感染により不死化したB細胞株を樹立し，疾患原因遺伝子ならびにその変異を同定し，マウスモデルなどを用いて変異に関する機能解析を行ってきた．

目的：疾患特異的induced pluripotent stem（iPS）細胞由来心筋細胞を作製して機能解析を行うため，心疾患患者由来の不死化B細胞株からiPS細胞の作製を行った．

方法：洞不全症候群患者の不死化B細胞株にマウスp53DD（dominant-negative），ヒトc-MYC，LIN28，SOX2，KLF-4，OCT3/4を電気刺激により導入した．

結果：遺伝子導入から約3週間の培養後，iPS細胞の形状を示す細胞が観察された．この細胞は，免疫染色の結果，胚性幹細胞（Embryonic stem cell）のマーカーとされる，Oct4，TRA-1-60，SSEA4，Nanog陽性であり，アルカリフォスファターゼ活性が陽性反応を示した．iPS細胞化においても，患者が有する遺伝子変異は保持され，EBウイルスのゲノムはiPS細胞化により消失した．

考察：疾患特異的iPS細胞が得られた．iPS化においても，疾患遺伝子の変異が保持され，EBウイルスの遺伝子発現が消失することは，ウイルスが影響しない病態モデルが作製可能であると考えられる．

結論：山中4因子とmp53DD，hLIN28遺伝子を導入して患者由来不死化B細胞から疾患特異的iPS細胞が作製されたことから，病態モデルの作製が期待される．

Our lab has identified the mutated genes responsible for congenital heart defects (CHD) using immortalized B cell lines established from the patient's blood. Using animal models, we have investigated how the mutations cause disease. However, because of the progress in induced pluripotent stem (iPS) cell technology, it would be better for us to use iPS cell-derived cardiac cells instead of mouse models. Therefore, we have established iPS cells from patients with long QT syndrome (LQTS) and sick sinus syndrome (SSS) and from normal controls. All established iPS cells expressed octamer-binding transcription factor-4 (Oct4), T-cell receptor alpha-1-60 (TRA-1-60), stage-specific embryonic antigen-4 (SSEA4), and Nanog genes and proteins and were alkaline phosphatase-positive. The mutated genes were not altered after reprogramming. Moreover, Epstein–Barr (EB) viral genes were not expressed after reprogramming. These results suggest that cardiac cells, such as cardiomyocytes, derived from iPS cells reflect the mutations of specific diseases and have no artifacts from the EB virus. Therefore, iPS cell-derived cardiac cells can be used as a powerful tool in in vitro disease models.

Key words: induced pluripotent cells; in vitro disease model; cardiomyocyte; channel; mutation

はじめに

我々は，先天性心疾患患者の遺伝子解析による原因の特定と，その治療法の検討を目的とした研究のためのツールとして，インフォームドコンセントを得た患者およびその家族から血液を採取し，EBウイルス感染による不死化細胞株を4200株以上樹立した．その細胞から病因遺伝子をシークエンスにより変異場所を同定するだけでなく，その変異が病態形成にどのようにつながっていくのかについても，検討を加えてきた^1–10)．たとえば，Noonan症候群患者においては，RAF1遺伝子の変異を同定した．この変異を含んだコンストラクトを導入した細胞では，in vitroでのキナーゼ活性の亢進やERKの活性化が認められた．またゼブラフィッシュ胚でのモルフォリノを用いたraf1のノックダウンにより，正常な心筋構造やその機能の発達にraf1が必要であることが示され，MAPK経路を活性化する新しいシグナル伝達機構であることが明らかになった¹¹⁾．

2006年にマウスのiPS細胞¹²⁾，2007年にヒトのiPS細胞^13,14)の作製が成功し，このような幹細胞が心筋細胞や神経細胞などへの分化能を有することが報告され，iPS細胞は，再生医療や，創薬に有用であることは多くの研究者が認めるところである．最近，網膜色素変性症の治療のためにiPS細胞から網膜色素上皮細胞を作製し，移植する臨床応用が行われて，再生医療への実用化が開始されたことで注目された¹⁵⁾．従来は変異動物を作製してその心臓における機能の異常を解析していたが，このようにiPS細胞作製，および分化誘導技術が向上したことから，先天性心疾患患者由来のB細胞株からiPS細胞の樹立し，これらのiPS細胞から心筋細胞を作製し，ヒトの心筋細胞で機能の解析を行うことは有効である．

iPS細胞由来心筋細胞の作製および先天性心疾患患者から作製されたiPS細胞由来心筋細胞（病態モデル）については，QT延長症候群など，心筋の拍動を司るイオンチャネルの遺伝子（SCN5A, KCNQ1）変異による疾患について，解析が進められてきた^16–23)．そこで，我々も，QT延長症候群，洞不全症候群（sick sinus syndrome; SSS）の病態モデルを作製するため，QT延長症候群，洞不全症候群と診断された患者の末梢血液細胞から不死化B細胞を樹立し，この細胞を用いてiPS細胞が作製できるかどうか，まず検討した．B細胞の不死化は，希少患者の血液サンプルを有効に使用できるため，多くの研究室で使われている手法である．最近，EBウイルス感染により不死化した細胞株からもiPS細胞が作製されることが報告されており^24,25)，我々も，このような先行研究を参考にして，iPS細胞作製を試みた．その結果，iPS細胞の特徴である，アルカリフォスファターゼ活性が陽性反応を示し，胚性幹細胞（embryonic stem (ES) cells）特異的遺伝子を発現するES細胞の形態を示す細胞が観察されたので，ここに報告する．

方法

インフォームドコンセントを得た患者から血液を採取し，B細胞にEBウイルスを感染させて²⁶⁾，細胞不死化B細胞を樹立した（東京女子医科大学倫理委員会承認済みである）．その細胞に，プログラムされたパルスの電気刺激（スーパーエレクトロポレーターNEPA21®）を与え，6種類の遺伝子，すなわち，ヒトOCT3/4，SOX2，KLF-4，c-MYC，LIN28，マウスp53DD（c-termical dominant negative）が入ったエピソーマルベクターを導入した（pCE-hOCT3/4, pCEhSK, pCE-hUL, pCD-mp53DD）^27,28)．その細胞を，マイトマイシンC処理したSNL細胞（フィーダー細胞）上に播き，ES細胞用培地中でiPS様細胞が出現するまで約3週間培養した．

培養液は，1，2日ごとに交換した．iPS細胞は，reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR），免疫染色法によって，ES細胞特異的遺伝子とタンパク質発現を確認した．また，免疫不全マウス（SCIDマウス，CB-17/Icr-scid/scid）の精巣に移植してテラトーマを形成させ，三胚葉への分化能を観察した．核型解析により，核型の異常が起こっていないか検討した．さらに，作製されたiPS細胞において，心疾患の原因遺伝子の変異が保たれているか否かをシークエンスで確認した．また，EBウイルスの遺伝子発現が，iPS化によりどのように変化するか，RT-PCR法により検討した．

結果

患者由来EBウイルス感染B細胞に，電気刺激による初期化遺伝子導入効率を検討したところ，ポワリング電圧（150 V）パルス（5 ms）刺激による遺伝子導入が，最も高い導入効率を示したため，この条件で遺伝子導入を行った．約3週間の培養後，iPS細胞の形状を示す細胞が観察された．Fig. 1にQT延長症候群患者由来B細胞から作製されたiPS細胞を示す．健常者（#1, 2），SSS症候群患者（#3, 4, 5），ならびにQT延長症候群患者（#6）由来B細胞株から作製されたiPS細胞は，すべて，アルカリフォスファターゼ活性が陽性反応を示した（Fig. 2）．免疫染色の結果，これらのiPS細胞は，ES細胞のマーカーとされる，TRA-1-60，SSEA4，Oct4，Nanog陽性であった．Fig. 3に，#3および#6の例を示す．また，免疫不全マウスの精巣において移植を行ったところ，テラトーマが形成され，三胚葉に由来する組織への分化が確認された（Fig. 4）．さらに，核型解析を行ったが，染色体の異常は見られなかった（Fig. 5）．

Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery 31(6): 313-319 (2015)

Fig. 1 A photographic image of iPS cells derived from B cells of a patient with LQTS

Fig. 2 Established iPS cells (#1 and #2 from normal controls, #3, #4, and #5 from patients with SSS, and #6 from a patient with LQT) are positive for alkaline phosphatase

Fig. 3 Established iPS cells (left 4 panels are from #3 and right 4 panels are from #6) express TRA-1-60 (A), SSEA4 (B), Nanog (C), and Oct4 (D) proteins

Fig. 4 Teratoma formation using #4 iPS cells

Teratoma tissues were removed from the testes of mice with severe combined immunodeficiency and fixed, sliced, and stained with hematoxylin and eosin. The left panels show lower magnification and the right panels show higher magnification of the boxed area (bar scale: 100 µm). All three germ layers were developed.

Fig. 5 Karyotype analysis using #4 iPS cells

No abnormalities were observed.

作製したiPS細胞のES細胞に発現する遺伝子の発現をRT-PCR法により検討したところ，ES細胞に発現する遺伝子であるLEFT-B，NODAL，REX，OCT3/4，SOX2，NANOGの遺伝子発現が検出された．Fig. 6に，#3および#6の結果を典型例として示す．その発現量は，山中らが作製したiPS細胞（253G1）と同様のレベルであった（data not shown）．心疾患の原因遺伝子の変異は，iPS化後も保持されていた（data not shown）．一方，不死化細胞樹立に用いられたEBウイルスの遺伝子発現（EBNA, LMP, BZLF, pEP4）は消失しており，サイレンス化していることが確認された（Fig. 6）．

Fig. 6 Gene expression of the embryonic stem and viral genes in established iPS cells

Upper Panel: Embryonic stem gene expression was observed in the iPS cells established from immortalized patient-derived B cell lines. Lower Panel: Left: EB virus-derived gene expression diminished in the iPS cells established from immortalized patient-derived B cell lines. Right: Immortalized B cells from the patients with the EB virus have expression of the viral genes.

考察

今回心疾患患者由来細胞から作製されたiPS様細胞は，ES細胞と類似した遺伝子発現，タンパク質発現を示すことのみならず，マウス精巣移植後に形成されたテラトーマでの三胚葉分化が示され，核型解析により，染色体の正常な形態を示したことから，iPS細胞であると結論する．さらに，今後，病態モデルとして用いられるには，自発的拍動を行うような心筋細胞へと分化させることが次の課題である．我々は，これらの点において，現在検討を進めている²⁹⁾．

iPS化により，心疾患原因遺伝子の変異が変化することはなかった．それに対して，不死化B細胞樹立に用いられたEBウイルスの遺伝子発現が消失することは，以前の報告にもあった^30,31)．これらの結果は，ウイルス由来分子がアーティファクトをもたらすことなく，病因遺伝子の保持により，病態が保持されると考えられ，病態モデル作製には，利点であると考えられる．

今回作製した，iPS細胞の一つは，洞不全症候群の患者由来であり，この疾患は，SCN5A遺伝子のエクソン9内のG1100G，A[Arg367Arg, His]の変異によって起こる³²⁾．SCN5Aは，Naチャネル遺伝子であり，この遺伝子に変異が起こると，洞結節から心筋細胞への信号伝導に異常を生じ，心筋細胞の収縮に異常が起こる．SCN5A変異による心臓病は，QT延長症候群やBrugada症候群が知られている^33–38)．また，遺伝子変異とこのような異常の発生に至る過程は，解明されていない．今後，iPS細胞由来心筋細胞のみならず，信号を作り出す洞結節の細胞，プルキンエ細胞なども作製することによって心臓内での信号伝達の機構がより明確になることが望まれると考えられる．

遺伝子変異をもつ先天性心疾患患者由来iPS細胞から心筋細胞を始めとする心臓の細胞を作製して，病態モデルを作製すれば，遺伝子変異と病態の関連性および，治療法の開発に役立てることができる．今後，このような包括的なシステムを構築し，病状の情報，遺伝子変異情報，家族情報との関連性を探索していく．

引用文献References

1) Dhandapany PS, Razzaque MA, Muthusami U, et al: RAF1 mutations in childhood-onset dilated cardiomyopathy. Nat Genet 2014; 46: 635–639

2) Fujita E, Nakanishi T, Nishizawa T, et al: Mutations in the cardiac troponin T gene show various prognoses in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy. Heart Vessels 2013; 28: 785–794

3) Chida A, Shintani M, Yagi H, et al: Outcomes of childhood pulmonary arterial hypertension in BMPR2 and ALK1 mutation carriers. Am J Cardiol 2012; 110: 586–593

4) Kodo K, Nishizawa T, Furutani M, et al: Genetic analysis of essential cardiac transcription factors in 256 patients with non-syndromic congenital heart defects. Circ J 2012; 76: 1703–1711

5) Razzaque MA, Komoike Y, Nishizawa T, et al: Characterization of a novel KRAS mutation identified in Noonan Syndrome. Am J Med Genet 2012; 158A: 524–532

6) Tsutsumi Y, Kosaki R, Itoh Y, et al: Vein of Galen aneurysmal malformation associated with an endoglin gene mutation. Pediatrics 2011; 128: e1307–e1310

7) Kodo K, Nishizawa T, Furutani M, et al: GATA6 mutations cause human cardiac outflow tract defects by disrupting semaphorin-plexin signaling. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106: 13933–13938

8) Tang S, Hoshida H, Kamisago M, et al: Phenotype-genotype correlation in a patient with co-occurrence of Marfan and LEOPARD syndromes. Am J Med Genet A 2009; 149A: 216–2219

9) Shintani M, Yagi H, Nakayama T, et al: A new nonsense mutation of SMAD8 associated with pulmonary arterial hypertension. J Med Genet 2009; 46: 331–337

10) Fujiwara M, Yagi H, Matsuoka R, et al: Implications of mutations of activin receptor-like kinase 1 gene (ALK1) in addition to bone morphogenetic protein receptor II gene (BMPR2) in children with pulmonary arterial hypertension. Circ J 2008; 72: 127–133

11) Razzaque MA, Nishizawa T, Komoike Y, et al: A Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome. Nat Genet 2007; 39: 1013–1017

12) Takahashi K, Yamanaka S: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663–676

13) Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al: Induction of pluripotent stem cells from human adult fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131: 861–872

14) Park I-H, Zhao R, West JA, et al: Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2007; 451: 141–147

15) Reardon S, Cyranoski D: Japan stem-cell trial stirs envy. Nature 2014; 513: 287–288

16) Yoshida Y, Yamanaka S: iPS cells: A source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol 2011; 50: 327–332

17) Kawaguchi N, Hayama E, Furutani Y, et al: Prospective in vitro models of channelopathies and cardiomyopathies. Stem Cells Int 2012; 2012: e439219

18) Moretti A, Bellin M, Welling A, et al: Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med 2010; 363: 1397–1409

19) Zhang H, Zou B, Yu H, et al: Modulation of hERG potassium channel gating normalizes action potential duration prolonged by dysfunctional KCNQ1 potassium channel. Proc Natl Acad Sci USA 2012; 109: 11866–11871

20) Itzhaki I, Maizels L, Huber I, et al: Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature 2011; 471: 225–229

21) Matsa E, Rajamohan D, Dick E, et al: Drug evaluation in cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells carrying a long QT syndrome type 2 mutation. Eur Heart J 2011; 32: 952–962

22) Malan D, Friedrichs S, Fleischmann BK, et al: Cardiomyocytes obtained from induced pluripotent stem cells with long-QT syndrome 3 recapitulate typical diseasespecific features in vitro. Circ Res 2011; 109: 841–847

23) Carvajal-Vergara X, Sevilla A, D’souza SL, et al: Patientspecific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature 2010; 465: 808–812

24) Choi SM, Liu H, Chaundhari P: Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood 2011; 118: 1801–1805

25) Rajesh D, Dickerson SJ, Yu J, et al: Human lymphoblastoid B-cell lines reprogrammed to EBV-free induced pluripotent stem cells. Blood 2011; 118: 1797–1800

26) Amoll MM, Carthy D, Ollier WER: EBV immortalization of human B lymphocytes separated from small volumes of cryo-preserved whole blood. Int J Epidomiology 2008; 37 Suppl 1: i41–i45

27) Okita K, Matsumura Y, Sato Y, et al: A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods 2011; 8: 409–412

28) Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, et al: An efficient nonviral method to generate integration-free human induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells 2013; 31: 458–466

29) Hayama E, Furutani Y, Kawaguchi N, et al: Manuscript in preparation

30) Rajesh D, Dickerson SJ, Yu J, et al: Human lymphoblastoid B-cell lines reprogrammed to EBV-free induced pluripotent stem cells. Blood 2011; 118: 1797–1800

31) Choi SM, Liu H, Chaudhari P, et al: Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood 2011; 118: 1801–1805

32) Vatta M, Dumaine R, Antzelevitch C, et al: Novel Mutations in domain 1 of SCN5A cause Brugada syndrome. Mol Genet Metab 2002; 75: 317–324

33) Wang Q, Curran ME, Splawski I, et al: Positional cloning of a novel potassium channel gene: KVLQT1 mutations cause cardiac arrhythmias. Nat Genet 1996; 12: 17–23

34) Curran ME, Splawski I, Timothy KW, et al: A molecular basis for cardiac arrhythmia: HERG mutations cause long QT syndrome. Cell 1995; 80: 795–803

35) Splawski I, Tristani-Firouzi M, Lehmann MH, et al: Mutations in the hminK gene cause long QT syndrome and suppress lks function. Nat Genet 1997; 17: 338–340

36) Wang Q, Shen J, Splawski I, et al: SCN5A mutations associated with an inherited cardiac arrhythmia, long QT syndrome. Cell 1995; 80: 805–811

37) Yamagishi H, Furutani M, Kamisago M, et al: A de novo missense mutation (R1623Q) of the SCN5A gene in a Japanese girl with sporadic long QT syndrome. Hum Mutat 1998; 11: 481

38) Splawski I, Timothy KW, Vincint GM, et al: Molecular basis of the long QT syndrome associated with deafness. N Engl J Med 1997; 336: 1562–1567

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