日本小児循環器学会雑誌 Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery

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〒162-0801東京都新宿区山吹町358-5アカデミーセンター Japanese Society of Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery Academy Center, 358-5 Yamabuki-cho, Shinju-ku, Tokyo 162-0801, Japan
Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery 31(6): 313-319 (2015)
doi:10.9794/jspccs.31.313

原著Original

先天性心疾患における不死化B細胞株由来induced pluripotent stem(iPS)細胞の樹立Establishment and Characterization of Induced Pluripotent (iPS) Stem Cells Derived from Immortalized B Cells of Cardiac Channelopathy Patients

1東京女子医科大学医学部循環器小児科教室Department of Pediatric Cardiology, School of Medicine, Tokyo Women's Medical University ◇ 〒162-8666 東京都新宿区河田町8番1号Kawada-cho 8-1, Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

2京都大学iPS細胞研究所初期化機構研究部門Department of Reprogramming Science, Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University ◇ 〒606-8507 京都府京都市左京区聖護院川原町53番地Shogoin Kawahara-cho 53, Sakyo-ku, Kyoto-shi, Kyoto 606-8507, Japan

3東京女子医科大学医学部病理診断科教室Department of Surgical Pathology, School of Medicine, Tokyo Women's Medical University ◇ 〒162-8666 東京都新宿区河田町8番1号Kawada-cho 8-1, Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

4若松河田クリニックWakamatsu-Kawada Clinic ◇ 〒162-0054 東京都新宿区河田町10番7号 グリーンヒルズ河田町2階Green Hills Kawada-cho 2F, Kawada-cho 10-7, Shinjuku-ku, Tokyo 162-0054, Japan

受付日:2014年12月24日Received: December 24, 2014
受理日:2015年8月31日Accepted: August 31, 2015
発行日:2015年11月1日Published: November 1, 2015
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背景:先天性心疾患患者や遺伝性不整脈患者で観察される心電図の波形異常は,心筋細胞におけるチャネルの異常や細胞肥大などによって生じる.我々は,これまでに先天性心疾患患者や遺伝性不整脈患者からEpstein–Barr(EB)ウイルス感染により不死化したB細胞株を樹立し,疾患原因遺伝子ならびにその変異を同定し,マウスモデルなどを用いて変異に関する機能解析を行ってきた.

目的:疾患特異的induced pluripotent stem(iPS)細胞由来心筋細胞を作製して機能解析を行うため,心疾患患者由来の不死化B細胞株からiPS細胞の作製を行った.

方法:洞不全症候群患者の不死化B細胞株にマウスp53DD(dominant-negative),ヒトc-MYCLIN28SOX2KLF-4,OCT3/4を電気刺激により導入した.

結果:遺伝子導入から約3週間の培養後,iPS細胞の形状を示す細胞が観察された.この細胞は,免疫染色の結果,胚性幹細胞(Embryonic stem cell)のマーカーとされる,Oct4,TRA-1-60,SSEA4,Nanog陽性であり,アルカリフォスファターゼ活性が陽性反応を示した.iPS細胞化においても,患者が有する遺伝子変異は保持され,EBウイルスのゲノムはiPS細胞化により消失した.

考察:疾患特異的iPS細胞が得られた.iPS化においても,疾患遺伝子の変異が保持され,EBウイルスの遺伝子発現が消失することは,ウイルスが影響しない病態モデルが作製可能であると考えられる.

結論:山中4因子とmp53DD,hLIN28遺伝子を導入して患者由来不死化B細胞から疾患特異的iPS細胞が作製されたことから,病態モデルの作製が期待される.

Our lab has identified the mutated genes responsible for congenital heart defects (CHD) using immortalized B cell lines established from the patient's blood. Using animal models, we have investigated how the mutations cause disease. However, because of the progress in induced pluripotent stem (iPS) cell technology, it would be better for us to use iPS cell-derived cardiac cells instead of mouse models. Therefore, we have established iPS cells from patients with long QT syndrome (LQTS) and sick sinus syndrome (SSS) and from normal controls. All established iPS cells expressed octamer-binding transcription factor-4 (Oct4), T-cell receptor alpha-1-60 (TRA-1-60), stage-specific embryonic antigen-4 (SSEA4), and Nanog genes and proteins and were alkaline phosphatase-positive. The mutated genes were not altered after reprogramming. Moreover, Epstein–Barr (EB) viral genes were not expressed after reprogramming. These results suggest that cardiac cells, such as cardiomyocytes, derived from iPS cells reflect the mutations of specific diseases and have no artifacts from the EB virus. Therefore, iPS cell-derived cardiac cells can be used as a powerful tool in in vitro disease models.

Key words: induced pluripotent cells; in vitro disease model; cardiomyocyte; channel; mutation

はじめに

我々は,先天性心疾患患者の遺伝子解析による原因の特定と,その治療法の検討を目的とした研究のためのツールとして,インフォームドコンセントを得た患者およびその家族から血液を採取し,EBウイルス感染による不死化細胞株を4200株以上樹立した.その細胞から病因遺伝子をシークエンスにより変異場所を同定するだけでなく,その変異が病態形成にどのようにつながっていくのかについても,検討を加えてきた1–10).たとえば,Noonan症候群患者においては,RAF1遺伝子の変異を同定した.この変異を含んだコンストラクトを導入した細胞では,in vitroでのキナーゼ活性の亢進やERKの活性化が認められた.またゼブラフィッシュ胚でのモルフォリノを用いたraf1のノックダウンにより,正常な心筋構造やその機能の発達にraf1が必要であることが示され,MAPK経路を活性化する新しいシグナル伝達機構であることが明らかになった11)

2006年にマウスのiPS細胞12),2007年にヒトのiPS細胞13,14)の作製が成功し,このような幹細胞が心筋細胞や神経細胞などへの分化能を有することが報告され,iPS細胞は,再生医療や,創薬に有用であることは多くの研究者が認めるところである.最近,網膜色素変性症の治療のためにiPS細胞から網膜色素上皮細胞を作製し,移植する臨床応用が行われて,再生医療への実用化が開始されたことで注目された15).従来は変異動物を作製してその心臓における機能の異常を解析していたが,このようにiPS細胞作製,および分化誘導技術が向上したことから,先天性心疾患患者由来のB細胞株からiPS細胞の樹立し,これらのiPS細胞から心筋細胞を作製し,ヒトの心筋細胞で機能の解析を行うことは有効である.

iPS細胞由来心筋細胞の作製および先天性心疾患患者から作製されたiPS細胞由来心筋細胞(病態モデル)については,QT延長症候群など,心筋の拍動を司るイオンチャネルの遺伝子(SCN5A, KCNQ1)変異による疾患について,解析が進められてきた16–23).そこで,我々も,QT延長症候群,洞不全症候群(sick sinus syndrome; SSS)の病態モデルを作製するため,QT延長症候群,洞不全症候群と診断された患者の末梢血液細胞から不死化B細胞を樹立し,この細胞を用いてiPS細胞が作製できるかどうか,まず検討した.B細胞の不死化は,希少患者の血液サンプルを有効に使用できるため,多くの研究室で使われている手法である.最近,EBウイルス感染により不死化した細胞株からもiPS細胞が作製されることが報告されており24,25),我々も,このような先行研究を参考にして,iPS細胞作製を試みた.その結果,iPS細胞の特徴である,アルカリフォスファターゼ活性が陽性反応を示し,胚性幹細胞(embryonic stem (ES) cells)特異的遺伝子を発現するES細胞の形態を示す細胞が観察されたので,ここに報告する.

方法

インフォームドコンセントを得た患者から血液を採取し,B細胞にEBウイルスを感染させて26),細胞不死化B細胞を樹立した(東京女子医科大学倫理委員会承認済みである).その細胞に,プログラムされたパルスの電気刺激(スーパーエレクトロポレーターNEPA21®)を与え,6種類の遺伝子,すなわち,ヒトOCT3/4SOX2KLF-4c-MYCLIN28,マウスp53DD(c-termical dominant negative)が入ったエピソーマルベクターを導入した(pCE-hOCT3/4, pCEhSK, pCE-hUL, pCD-mp53DD)27,28).その細胞を,マイトマイシンC処理したSNL細胞(フィーダー細胞)上に播き,ES細胞用培地中でiPS様細胞が出現するまで約3週間培養した.

培養液は,1,2日ごとに交換した.iPS細胞は,reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR),免疫染色法によって,ES細胞特異的遺伝子とタンパク質発現を確認した.また,免疫不全マウス(SCIDマウス,CB-17/Icr-scid/scid)の精巣に移植してテラトーマを形成させ,三胚葉への分化能を観察した.核型解析により,核型の異常が起こっていないか検討した.さらに,作製されたiPS細胞において,心疾患の原因遺伝子の変異が保たれているか否かをシークエンスで確認した.また,EBウイルスの遺伝子発現が,iPS化によりどのように変化するか,RT-PCR法により検討した.

結果

患者由来EBウイルス感染B細胞に,電気刺激による初期化遺伝子導入効率を検討したところ,ポワリング電圧(150 V)パルス(5 ms)刺激による遺伝子導入が,最も高い導入効率を示したため,この条件で遺伝子導入を行った.約3週間の培養後,iPS細胞の形状を示す細胞が観察された.Fig. 1にQT延長症候群患者由来B細胞から作製されたiPS細胞を示す.健常者(#1, 2),SSS症候群患者(#3, 4, 5),ならびにQT延長症候群患者(#6)由来B細胞株から作製されたiPS細胞は,すべて,アルカリフォスファターゼ活性が陽性反応を示した(Fig. 2).免疫染色の結果,これらのiPS細胞は,ES細胞のマーカーとされる,TRA-1-60,SSEA4,Oct4,Nanog陽性であった.Fig. 3に,#3および#6の例を示す.また,免疫不全マウスの精巣において移植を行ったところ,テラトーマが形成され,三胚葉に由来する組織への分化が確認された(Fig. 4).さらに,核型解析を行ったが,染色体の異常は見られなかった(Fig. 5).

Pediatric Cardiology and Cardiac Surgery 31(6): 313-319 (2015)

Fig. 1 A photographic image of iPS cells derived from B cells of a patient with LQTS

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Fig. 2 Established iPS cells (#1 and #2 from normal controls, #3, #4, and #5 from patients with SSS, and #6 from a patient with LQT) are positive for alkaline phosphatase

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Fig. 3 Established iPS cells (left 4 panels are from #3 and right 4 panels are from #6) express TRA-1-60 (A), SSEA4 (B), Nanog (C), and Oct4 (D) proteins

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Fig. 4 Teratoma formation using #4 iPS cells

Teratoma tissues were removed from the testes of mice with severe combined immunodeficiency and fixed, sliced, and stained with hematoxylin and eosin. The left panels show lower magnification and the right panels show higher magnification of the boxed area (bar scale: 100 µm). All three germ layers were developed.

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Fig. 5 Karyotype analysis using #4 iPS cells

No abnormalities were observed.

作製したiPS細胞のES細胞に発現する遺伝子の発現をRT-PCR法により検討したところ,ES細胞に発現する遺伝子であるLEFT-BNODALREXOCT3/4SOX2NANOGの遺伝子発現が検出された.Fig. 6に,#3および#6の結果を典型例として示す.その発現量は,山中らが作製したiPS細胞(253G1)と同様のレベルであった(data not shown).心疾患の原因遺伝子の変異は,iPS化後も保持されていた(data not shown).一方,不死化細胞樹立に用いられたEBウイルスの遺伝子発現(EBNA, LMP, BZLF, pEP4)は消失しており,サイレンス化していることが確認された(Fig. 6).

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Fig. 6 Gene expression of the embryonic stem and viral genes in established iPS cells

Upper Panel: Embryonic stem gene expression was observed in the iPS cells established from immortalized patient-derived B cell lines. Lower Panel: Left: EB virus-derived gene expression diminished in the iPS cells established from immortalized patient-derived B cell lines. Right: Immortalized B cells from the patients with the EB virus have expression of the viral genes.

考察

今回心疾患患者由来細胞から作製されたiPS様細胞は,ES細胞と類似した遺伝子発現,タンパク質発現を示すことのみならず,マウス精巣移植後に形成されたテラトーマでの三胚葉分化が示され,核型解析により,染色体の正常な形態を示したことから,iPS細胞であると結論する.さらに,今後,病態モデルとして用いられるには,自発的拍動を行うような心筋細胞へと分化させることが次の課題である.我々は,これらの点において,現在検討を進めている29)

iPS化により,心疾患原因遺伝子の変異が変化することはなかった.それに対して,不死化B細胞樹立に用いられたEBウイルスの遺伝子発現が消失することは,以前の報告にもあった30,31).これらの結果は,ウイルス由来分子がアーティファクトをもたらすことなく,病因遺伝子の保持により,病態が保持されると考えられ,病態モデル作製には,利点であると考えられる.

今回作製した,iPS細胞の一つは,洞不全症候群の患者由来であり,この疾患は,SCN5A遺伝子のエクソン9内のG1100G,A[Arg367Arg, His]の変異によって起こる32)SCN5Aは,Naチャネル遺伝子であり,この遺伝子に変異が起こると,洞結節から心筋細胞への信号伝導に異常を生じ,心筋細胞の収縮に異常が起こる.SCN5A変異による心臓病は,QT延長症候群やBrugada症候群が知られている33–38).また,遺伝子変異とこのような異常の発生に至る過程は,解明されていない.今後,iPS細胞由来心筋細胞のみならず,信号を作り出す洞結節の細胞,プルキンエ細胞なども作製することによって心臓内での信号伝達の機構がより明確になることが望まれると考えられる.

遺伝子変異をもつ先天性心疾患患者由来iPS細胞から心筋細胞を始めとする心臓の細胞を作製して,病態モデルを作製すれば,遺伝子変異と病態の関連性および,治療法の開発に役立てることができる.今後,このような包括的なシステムを構築し,病状の情報,遺伝子変異情報,家族情報との関連性を探索していく.

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