1. 心臓前駆細胞の発生と各心臓コンポーネントへの寄与
細胞系譜を追跡する技術の開発は，心臓発生起源の特定に大幅な進展をもたらした．心臓原基は，マウス胚の胎生（E）7.5日（人における妊娠2週目まで）に胎仔前方に三日月形（cardiac crescent）を形成する（Fig. 1）．この側板中胚葉に由来する心臓前駆細胞の三日月型プールは一次心臓領域（first heart field: FHF）と呼ばれ1, 2），FHFは最終的に左心室と原始心房を形成する．マウスではE8.0，ヒトでは妊娠3週に，この心臓前駆細胞群は腹側正中線上で融合し，心内膜細胞の内層と心筋細胞の外層とからなる原始心筒を形成する．二つの層の間には相互シグナリングを介在する心ゼリーと呼ばれる基質が存在する．
その後2001年に，複数の研究グループから，FHFとは異なる，第2の心臓前駆細胞集団の存在が報告された3–6）．この心臓前駆細胞集団は二次心臓領域（second heart field: SHF）と呼ばれ，臓側中胚葉に由来する．SHFはcardiac crescentの外側に存在し，次いで原始心筒の後方に位置するようになる．SHF由来心臓前駆細胞はその後原始心筒の動脈側および静脈側より原始心筒内に流入する．原始心筒が右回りにルーピングする時期には，SHF由来心臓前駆細胞は心臓流出路および右心室，両側心房の大部分の心筋を構成する．また，SHF由来の心筋細胞が供給されることにより心臓流出路の伸長が生じる．この過程は，両大血管が左右心室と正しく整列するための心臓流出路のローテーションに必須である．
心臓前駆細胞の第3の系統となる，心臓神経堤細胞（caridac neural crest cells: cNCCs）は，中耳プラコードと第3体節の尾側境界との間の背側神経管に由来する7）．背側神経管から剥離した後，cNCCsは尾側咽頭弓から第3, 4および6咽頭弓に遊走し，大動脈弓の形成に参加する．さらに一部のcNCCsは心臓流出路に到達し，流出路中隔を形成する．cNCCs–SHF間の相互作用は，心臓流出路および大動脈弓の発達に不可欠であり，複数のシグナル伝達経路が，cNCCsの遊走および流出路中隔を形成するための集塊形成を制御する8）．
心臓前駆細胞の第4の系統は，発生初期胚の心臓と肝臓の間にできる横中隔間葉組織（septum transversum）から発生する心外膜前駆組織（proepicardium: PE）である9）．心外膜および冠動脈の細胞の一部は，PEから生じる．PEは胎児心臓に向かって伸長，付着し，心筋表面に広がった後に心外膜を形成する．心外膜形成過程で，一部のPEおよび心外膜細胞が上皮-間葉転換を受け，心外膜下組織から心筋層に入り，冠動脈平滑筋および線維芽細胞へと分化する10）（Fig. 1）．
2. 心臓前駆細胞発生を制御する転写因子群
心筋細胞系譜の運命決定を制御する因子の解明に関して，注目すべきブレイクスルーは，ショウジョウバエの原始的な心臓の形成に必要とされるホメオボックス遺伝子tinman（tin）の発見であった11, 12）．tinmanが欠失したショウジョウバエ胚は心臓が欠如する．一方，tinmanのhomologであるNkx2.5が欠損したマウスは，心臓の初期発生は正常に起こるが，原始心筒の異常形態形成および左心室発達不全により胎生致死となる13）．この報告は，マウスにおけるNKX2.5は，ショウジョウバエ胚におけるtinmanと異なり，他の遺伝子群が相補的な作用を示すことにより，心臓系譜の決定に複雑に関与する可能性を示すものであり，その後多くの研究により，心臓発生過程に必須の心臓転写因子群による複雑な遺伝子制御ネットワークが明らかになりつつある（Fig. 2）．
NKX2.5が全心臓前駆細胞に発現するのに対し，LIM-ホメオドメイン転写因子Islet1（ISL1）は初期発生過程でSHFに発現し，SHF系譜の決定における役割を果たす．MADS-box factor myocyte enhancer factor-2（MEF2）は，他の転写因子と協同して，筋原線維タンパク質をコードする遺伝子の発現を直接的に活性化する．脊椎動物に存在する四つのMef2遺伝子（Mef2a, -b, -cおよび-d）の中で，Mef2cは心筋収縮タンパク質の発現および心室構造の発達に必要である14）．Mef2c欠損マウスは，SHFの発生障害による右心室低形成を呈する．ジンクフィンガー転写因子のGATAファミリーのメンバーは，脊椎動物において6種存在する．GATAファミリーのうち，GATA4/5/6はNKX2.5, MEF2等の心臓転写因子と協調的に，多数の心筋収縮タンパク質をコードする遺伝子の発現を直接制御し，FHFおよびSHFの発生の中心的役割を果たす15）．T-box（Tbx）遺伝子ファミリーは，心臓系譜細胞の誘導，分化および形態形成を制御する16）．Tbx5を欠損したマウスは，FHFの発生が障害され，心臓流入路側の重度の低形成を示し胎生致死となる17）．TBX20は機能心筋の誘導および増殖に主要な役割を果たし，心室形成に関与する18）．TBX2およびTBX3は，TBX20と拮抗的に作用し，刺激伝導系の発生に寄与する19）．22q11.2領域に含まれるT-box型転写因子TBX1は，心臓および頭蓋顔面疾患の主要な表現型を決定する疾患原因遺伝子として同定された．TBX1はSHFに発現し，Tbx1欠失マウスは22q11.2欠失症候群（22q11DS）と同様の心血管表現型を有する20）．心臓流出路におけるTBX1発現量の調節は，folkhead型転写因子群FOXA2, FOXC1, FOXC2が重要な役割を果たす21, 22）．bHLH型転写因子のHANDファミリーのHAND1はFHFに有意な発現を示し，Hand1欠損マウスでは，変異胚は原始心筒の外側湾曲が障害される．HAND2は，主に右心室および心臓流出路に発現し，Hand2欠損マウスは，右心室の重度の形成不全をきたす23）．
cNCCsは，さまざまなシグナル因子と相互作用し，これらの分泌因子に近接する多くの構造の形成に関与する．近年注目されているcNCCsの心臓流出路への遊走を制御する因子の一つにSemaphorin 3C（SEMA3C）が挙げられる24）．胎生期総動脈幹の肺側心筋はSEMA3Cを発現するが，cNCCはその受容体PlexinA2（PLXNA2）を発現し，SEMA3Cの濃度勾配に従って引き寄せられる．このシグナリングは，心臓流出路へのcNCCsの正確な遊走に必要である25, 26）．
心臓流出路の発生にはSHFおよびcNCCsの正常な発生および相互作用が必須となる．そのため，それら二つの心臓前駆細胞の発生制御因子は心臓流出路発生異常の責任遺伝子となる可能性がある．実際にSHFおよびcNCCsの発生制御機構を解析した一連の研究例を以下に示す．
3. 心臓転写因子変異と心臓流出路発生異常
発生制御機構の解析において，疾患原因遺伝子の解析はヒト発生異常疾患の病因に関連した強力なエビデンスを提供しうる．遠隔期予後が問題となる重症心臓流出路異常を有する患者DNAを用いた遺伝子変異解析を行った研究では27, 28），転写因子群の中でも特にGATA転写因子ファミリーのGATA4およびGATA6に多くの変異が同定された．GATA4/6は，心臓発生に必須であり，マウスにおけるGata6のノックアウトは，内胚葉分化の欠陥による初期胚の致死をもたらす．Gata4およびGata6ヌル対立遺伝子のヘテロ接合体マウスは，子宮内で死亡し，心室中隔および流出路中隔欠損を含む総動脈管遺残（PTA）のスペクトルを示す29）．これらの実験動物を用いた先行研究の結果は，GATA6が心臓形成に必須の遺伝子群の発現を誘導するため，GATA4と協同して機能する可能性を示している．
GATA6遺伝子変異の影響を確認するために，次に我々は2例のPTA患者に認められた変異の機能解析を行った27）（Fig. 3A）．1例の両親は変異，心疾患ともに認めず，発端者はde novo変異であることが判明した．またもう1例では，肺動脈弁の構造異常を含むCHDを有する父および姉妹に発端者と同一の変異が認められ，心疾患を有さない母には変異は存在せず，遺伝子変異と心疾患の相関が確認された（Fig. 3B）．近年，Gata6の神経提細胞特異的欠失マウスの心臓表現型は，PTAを呈し胎生致死をきたすことが報告され，GATA6がcNCCsの発生に機能することが示唆された30）．そこで我々は“GATA6がcNCCsの流出路への遊走をコントロールする”という仮説を立て，SEMA3Cシグナルに焦点を当て，検討を行った27）．まず，マウス胎仔のGata6, Sema3cおよびPlxna2の発現を確認したところ，それらの遺伝子はすべて心臓流出路に発現することが確認された．さらにSEMA3C, PLXNA2の5′側上流に，GATA6が直接結合し，遺伝子発現を調節するエンハンサー領域が存在し，GATA6変異体がそれらエンハンサーに対する転写活性を失っていることが確認された．さらにトランスジェニックマウスを用いた検討では，実際の生体内において心臓流出路のSEMA3CおよびPLXNA2発現がGATA転写因子によって制御されていることが示された（Fig. 3C, D）．これらの結果から導き出される結論として，GATA6がSEMA3CおよびPLXNA2の発現を上流で直接制御し，その破綻はcNCCsの発生を障害し，ヒト心臓流出路発生異常の原因となると考えられた．
4. 心臓流出路発生を制御するセマフォリンシグナルの分子制御機構
Tbx1欠失マウスの先行研究で，Foxc1/x2欠失マウスと同様に，SEMA3Cの心臓流出路における発現低下が報告された31）．そこで22q11.2DSのモデルマウスであるTbx1発現低下マウスを用いて，SEMA3C発現パターンの詳細な変化を検討したところ，咽頭弓領域におけるSEMA3C発現が，Tbx1発現低下マウスでは増強している様子が確認された32）（Fig. 4A）．Tbx1発現低下マウスのcNCCsの遊走・分布パターンを観察したところ，野生型に比して心臓流出路領域へ遊走する細胞数が減少する一方で，咽頭弓領域で遊走が停滞し，集塊を作るcNCCsが観察された．TBX1とSEMA3Cの間を介在する因子を検索した結果，TBX1の制御下にSHFより発現，分泌されるFGF8がcNCCsにおけるSEMA3Cの発現を抑制することが明らかとなった．ニワトリ胚とウズラ胚のキメラを用いたex ovoの実験系において，咽頭弓領域にFGF8の中和抗体を注入したキメラ胚では，cNCCsが心臓流出路まで到達せず，FGF8抗体の注入部位でその遊走が停滞する様子が観察された（Fig. 4B）．また，ニワトリ胚の第IV–VI咽頭弓動脈間にFGF8中和抗体を注入した後，発生を追跡すると，第IV咽頭弓動脈の発育不全が観察された．
これらの一連の研究結果よりGATA6は流出路基部におけるSEMA3Cの発現を正に制御する一方で，咽頭弓領域ではTBX1がFGF8を介して，cNCCsの異所性SEMA3C発現を抑制することが明らかとなった．すなわち，SHFにおける心臓転写因子群が，時間的，空間的にSEMA3C発現を制御することにより，cNCCsの適切な咽頭弓動脈および心臓流出路への遊走を制御することが明らかとなった（Fig. 4C）．
前述のように，心臓転写因子の重要な機能として，心臓形態発生の制御が挙げられるが，一方で，心筋分化および心室構造の形成にも中心的な役割を果たすことが知られている．しかしこれまで，ヒト心筋細胞の発生を直接観察することは，胎児を研究に用いるという倫理的問題上困難であった．2005年のiPS細胞の開発というブレイクスルーは，これまでのヒト疾患研究の規定概念を変え，患者細胞を使用してヒト幹細胞から体細胞への発生分化過程の異常を再現するという新たな研究戦略を可能とするパラダイムシフトを引き起こした．以下にiPS細胞を利用した，新たな小児循環器領域における研究の方向性を述べる．
発症原因が心室筋形成の発生過程の障害と密接に関連すると考えられる心疾患として，左室心筋緻密化障害（left ventricular non compaction: LVNC）が挙げられる33）．心筋緻密化は，肉柱形成，緻密層増殖および肉柱層リモデリングの各プロセスが，時間的・空間的に制御されることにより完成される．これまでにヒトおよび動物を用いた研究で，心筋細胞の細胞周期制御に関わる遺伝子群の変異が胎児心筋細胞の増殖能異常を引き起こし，LVNC様の表現型を呈する例が報告されてきたが，その詳細なメカニズムは未だ不明である34–41）．iPS細胞由来心筋細胞（iPS cell-derived cardiomyocyte: iPS-CM）は，患者の遺伝的背景をそのまま保存しており，疾患モデルへの利用が期待される．そこで今回我々は，その病因を明らかにするため，LVNC家族歴を有する家系から疾患特異的iPS細胞を作製した42）（Fig. 5A）．LVNC患者由来iPSC-CMsをコントロール群と比較したところ，LVNC群に有意な増殖能低下が確認された（Fig. 5B）．LVNC iPSC-CMsに認められた増殖能低下の原因を解明するため，RNAシークエンシングを用いた網羅的遺伝子発現解析を行った結果，Upstream解析でLVNC iPSC-CMsは，コントロール群と比べてTGFβシグナルの活性化が顕著であることが示された．TGFβシグナルの活性化が心筋細胞増殖能に与える影響を調べるため，培地にTGFβ1を添加したところ，iPSC-CMsのS期心筋細胞率は有意に低下し，TGFβが心筋細胞増殖に抑制的に作用する可能性が考えられた．
この家系における疾患原因遺伝子の解明のため，エクソームシークエンスを用いて，発端者，同胞および両親の網羅的遺伝子変異解析を行った結果，心臓表現型の有無に一致してTBX20のナンセンス変異が認められた（Fig. 5A, C）．TBX20がLVNCの疾患原因遺伝子であることを証明するために，富山大学，市田蕗子先生をはじめとする諸先生方のご協力のもとに，LVNC患者78名のDNAを解析したところ，孤発例1人よりDNA結合領域にde novo点変異が検出され，TBX20変異の病原性が証明された（Fig. 5A, C）．TBX20の障害が心筋細胞内でTGFβシグナル活性に与える影響を調べるため，ヒトES細胞のTBX20をノックダウンした細胞株を作製し，心筋分化誘導後に細胞増殖能およびTGFβシグナル関連因子の発現を調べた結果，LVNC iPS-CMと同様にTBX20ノックダウンES細胞由来心筋細胞は，その細胞増殖能は低下し，TGFβ関連遺伝子の発現は著明に増加することが確認され，TBX20遺伝子の機能障害がTGFβシグナル活性化を引き起こす可能性が示唆された．さらにLVNC患者の心臓でTGFβシグナルの活性化が認められることを確認するため，発端者の移植時に摘出した心臓をサンプルとして解析を行ったところ，iPSC-CMsの所見と同様に，発端者心筋ではTGFβシグナル下流のSMADのリン酸化亢進が認められた（Fig. 5D）．
次に我々は，TGFβシグナルの活性化が生体内の心筋発生に与える影響を調べるため，心筋細胞特異的にTGFβ1を発現し，発現量をdoxycyclineにより調節可能なトランスジェニックマウスを作製した．TGFβ1を中等度に発現亢進させたマウスは胎生13日までに死亡した．胎生12.5日の心筋を解析したところ，緻密層心筋細胞の増殖が低下し，緻密層が菲薄化していることが明らかとなった．
最後に治療へ関連する知見として，LVNC iPSC-CMsの表現型を救済するため，TGFβシグナルの修正，およびDNAレベルでの修復を試みた．TGFβ受容体の特異的な阻害作用を有する低分子化合物を用いてTGFβシグナルを阻害することにより，LVNC iPSC-CMsの細胞増殖能は改善した．さらに，発端者由来iPS細胞にゲノム編集を行い，TBX20変異配列を正常配列で置換したところ，LVNC iPSC-CMsの増殖能低下は改善が認められ，TBX20変異がLVNC iPSC-CMsの表現型に主たる影響を与えていることが確認された．以上の結果をまとめると，TBX20はTGFβシグナルを抑制し，胎児心筋増殖を促し，緻密層形成に貢献するが，TBX20遺伝子変異によりTBX20の機能が損なわれると，TGFβシグナルの異常活性化が惹起される．TGFβシグナルの亢進は胎児心筋増殖を障害し，緻密層形成不全が引き起こされ，LVNCが発症すると考えられた（Fig. 5E）．従来の遺伝子変異解析と動物モデルに加えて，ヒト組織および患者由来iPS細胞より心臓構成細胞を作製し，表現型解析を行うことにより，ヒトにおける心臓発生過程の異常に際しても，詳細な病因解明および薬剤開発への足掛かりとなる有用な所見が得られる可能性がある．今後このような手法により，多くのCHDの病態解明，治療法開発が発展することが期待される．
